Unter Ruprecht III. wurde der Chor der Kirche abgerissen und durch einen größeren ersetzt. Der Hallenchor wurde 1410 vollendet, der Langhausbau mit dem Unterbau des Turmes im Jahre 1441. Ludwig III. legte den Grundstock zur späteren so berühmten Pfälzischen Bibliothek, der BIBLIOTECA PALATINA, indem er die ersten Bücher auf den Emporen der Heiliggeistkirche aufstellen ließ. Während der Regierungszeit Ludwig V. (1508-1544) wurde der Turm weitergebaut und fertiggestellt. Im Zuge der Reformation wechselte die Kirche mehrfach zwischen lutherischer und reformiert-calvinistischer Konfession. 1563 entstand als reformiertes Bekenntnis der Heidelberger Katechismus. Mit dem 30-jährigen Krieg und der Eroberung Heidelbergs durch katholische Truppen wurde die Stadt und die Kirche für viele Jahre katholisch und als Kriegsbeute lies Papst Gregor XV. die BIBLIOTECA PALATINA 1623 nach Rom bringen. Im Zuge des pfälzisch-orléansschen Erbfolgekriegs wurde die Kirche 1693 stark beschädigt. Fast alle Grabplatten der Kurfürsten von der Pfalz wurden zerstört, erhalten ist die des Kurfürsten Ruprecht II. Von den einst 5000 Büchern und 3524 Handschriften gelangten 1816 nur noch 885 zurück nach Heidelberg, alle übrigen verblieben im Vatikan. In den folgenden zwei Jahrhunderten wurde von katholischer wie protestantischer Seite gleichermaßen Anspruch auf die Kirche geltend gemacht, so dass, durch eine Scheidemauer getrennt, im Chorraum die katholische Messe, im Langhaus der evangelische Gottesdienst gefeiert wurden. Erst 1936 kam es zur Einigung mit der katholischen Kirche; die Kirche ging ganz in den Besitz der Evangelischen Kirche in Baden über. Zum Johannisfest 1936 feierte die evangelische Heiliggeistgemeinde erstmals wieder Gottesdienst in einer Kirche ohne Scheidemauer.
